哥也色

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的病死率在大家癌症升天率中排行第二，况且是大家癌症辩论升天的第三大主要原因[1]， 约莫50%的HCC是由乙型肝炎病毒(hepatitis B Virus，HBV)感染引起的[2]。而在HBV中， 病毒颐养卵白HBx的永久踏实抒发不错浩大细胞转录和增殖，并使肝细胞对致癌因子明锐。在肝癌的早期，HBx是HBV的要道卵白，起宝贵要作用，它被召募到细胞染色质中并颐养特定遗传基因座的染色质能源学[3]。MiRNA是小的保守非编码RNA，可与靶基因mRNA分子的3'-UTR互补，从而促进靶基因mRNA的降解或扼制mRNA翻译。它在颐养基因抒发中起要害作用，并参与多种生物学历程。现存斟酌傲气，HBx可通过上调或下调miRNA抒发来指引肝癌的发展[4-6]。MiRNA-145是现在已发现的抑癌基因， 其通过颐养靶基因c-Myc和Kras的抒发来颐养肿瘤细胞的增殖[7-9]。而c-Myc和Kras作为原癌基因，在癌症发展历程中均为高抒发[10]。miRNA-145在肝癌中作为抑癌基因处于低抒发水平[11-12]，而在胃癌中，miRNA-145不错通过扼制靶基因c-Myc的抒发来扼制胃癌细胞的增殖和侵袭[13]。

由于HBx是否能导致HCC这一表面和具体机制均尚未讲述，本斟酌采选转染HBx的肝前体细胞(HBx-EGFP-14-19)和转染HBx不同期间段的小鼠，不雅察HBx对miRNA-145a-5p偏持靶基因c-Myc和Kras的颐养作用；通过赐与HBx-EGFP-14-19细胞和HBx小鼠(饲养至180 d)miRNA-145a-5p模拟物和扼制剂，不雅察miRNA-145a-5p对肝细胞的凋一火、增殖和周期的颐养作用，探讨HBx指引HCC的机制，为HBx导致HCC表面提供新的依据，也为HCC的会诊和调养奠定基础。

长生化小鼠肝前体细胞株14-19由好意思国芝加哥大学分子肿瘤斟酌中心送礼，经慢病毒转染后的EGFP-14-19(空载对照)和HBx-EGFP-14-19细胞株由本课题组前期构建并保存。无独特病原体(specific pathogen free，SPF)级昆明小鼠由重庆医科大学动物中心提供并饲养。

FBS胎牛血清购自CELL BOX公司，细胞培养基DMEM(高糖)购自HyClone公司，TRIzol总RNA索要试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，柱式microRNA抽提试剂盒和miRNA第一链cDNA合成(茎环法)试剂盒均购自上海生工生物工程(上海)股份有限公司，回转录试剂盒购自Vazyme公司，2×SYBR Green qPCR Master Mix购自Bimake公司，HBx抗体购自Abcam公司，GAPDH抗体购自Cell Signaling Technology公司，c-Myc、Kras抗体购自Abcepta公司，Bad、Bax、Bcl-2抗体均购自Abclonal公司，CDK4、CyclinE抗体购自万类生物科技有限公司， CyclinE抗体购自Abways公司，EndoFectinTM-Max转染试剂购自GeneCopoeia公司，miRNA-145a-5p mimic、inhibitor、agomir、antagomir均购自莱博斯生物公司，CCK-8试剂盒购自MCE公司，SDS-PAGE凝胶设置试剂盒购自碧云天生物技艺公司，ECL显影液购自Advansta公司，DAB显色液及免疫组化SP试剂盒购自北京中山金桥生物技艺有限公司。

肝前体细胞株14-19、EGFP-14-19、HBx-EGFP-14-19在含有10%胎牛血清的DMEM高葡萄糖培养基中于37 ℃，5%CO2条款下培养，并传代3次后进行后续测试。细胞转染时候为6组：①normal组(HBx-EGFP-14-19细胞)，②EndoFectin组(HBx-EGFP-14-19细胞+转染试剂)，③mimics-miR-145组(HBx-EGFP-14-19细胞+转染试剂+mimics-miR-145)，④mimics-NC-miR145组(HBx-EGFP-14-19细胞+转染试剂+mimics-NC-miR-145)，⑤inhibitor-miR-145组(HBx-EGFP-14-19细胞+转染试剂+inhibitor-miR-145)，⑥inhibitor-NC-miR-145组(HBx-EGFP-14-19细胞+转染试剂+inhibitor-NC-miR-145)。

凭据课题组前期报谈[14]，构建动物模子时，将小鼠分为3组：生理盐水组(n=10)、EGFP-14-19细胞组(n=10)和HBx-EGFP-14-19细胞组(n=40)。辞别将200 μL生理盐水、EGFP-14-19细胞和HBx-EGFP-14-19细胞(5×105细胞悬浮于200 μL PBS)悬浮液通过肝门静脉打针入小鼠体内。采选6~8周龄的小鼠，手术前24 h禁食，乙醚麻醉小鼠，待小鼠眩晕后固定其当作，用乙醇对腹部进行消毒，剑突下行约2 cm纵向切口使肝门静脉泄漏，用血管夹夹住门静脉远端，从近端冉冉打针。打针完成后，用PBS湿润的棉签按压止血，并在止血后速即缝合腹腔。肝脏网罗时期为手术后30、90、180、360 d。进行机理斟酌时将小鼠分为6组：①HBx 180 d组(n=10)，②HBx 180d-NS(生理盐水)组(n=10)，③HBx 180d-agomir-miR-145组(n=10)，④HBx 180 d-agomir-NC-miR-145(阴性对照)组(n=10)，⑤HBx 180 d-antagomir-miR-145组(n=10)，⑥HBx 180 d-antagomir-NC-miR-145(阴性对照) 组(n=10)。术后180 d，通过尾静脉打针agomir-miR-145a-5p、antagomir-miR-145a-5p、agomir-NC-miR-145a-5p、antagomir-NC-miR-145a-5p和生理盐水。24 h后对小鼠扩充安乐死。通盘网罗的肝脏组织保存在4%多聚甲醛和液氮中，以备后续锻真金不怕火使用。

miR-145a-5p模拟物是双链RNA：有义序列(5′-GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU-3′)和反义序列(5′-AGGGAUUCCUGGGAAAACUGGAC-3′)，miR-145a-5p扼制剂为单链(5′-AGGGAUUCCUGGGAAAACUGGAC)，且与miR-145a-5p皆备互补。非靶向的阴性对照序列(关于模拟物：有义序列5′-UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA-3′；反义序列5′-UCUACUCUUUCUAGGAGGUGUUGUGA-3′；关于扼制剂：5′-UCUACUCUUUCUAGGAGGUUGUGA-3′)用作对照。模拟物和扼制剂用于体外执行；miR-145a-5p agomir和antagomir辞别与模拟物序列和扼制剂序列相似哥也色，但对组织细胞的亲和力更高，因此将agomir和antagomir用于体内执行。

小鼠肝脏切片脱蜡后染色并封片，于光学显微镜下不雅察拍照。

总RNA和miRNA经索要后检测其质料和相应浓度，回转录试剂盒将RNA和miRNA(茎环法)回转录为cDNA，诓骗SYBR荧光定量法检测其浓度，检测体系为10 μL (cDNA 2μL，SYBR 5 μL，引物1 μL，无酶水2 μL)。引物序列见表 1。

将适量的小鼠肝组织放入象征好的EP管中，加入200 μL事先配制的裂解液(RIPA ∶PMSF =100 ∶1)，用组织研磨机充分研磨后，在冰上放弃30 min，每5分钟振动1次。裂解后，于4 ℃以12 000 r/min离心20 min，吸出上清液，用BCA法测定卵白质浓度。将上样缓冲液添加到剩余的上清液中，在100 ℃下加热15 min，然后在-80 ℃下保存。电泳分离卵白质后将其滚动到PVDF膜上，用5%的脱脂奶粉阻塞2 h，摇床上孵育一抗，于4 ℃下过夜。经TBST洗涤后，将PVDF膜与二抗在室温下孵育2 h。用ECL显色法显色，Analysis分析软件对想法条带进行检测分析。

HBx-EGFP-14-19细胞在96孔(或6孔)平板中以1×105/mL的浓度培养。用EndoFectinTM-Max转染试剂转染miR-145a-5p mimic、miR-145a-5p mimic NC、miR-145a-5p inhibitor和miR-145a-5p inhibitor NC。转染24 h后，进行后续操作。

在96孔板中以1×105/mL的浓度培养HBx-EGFP-14-19细胞，并凭据上述转染纪律对其进行处理。转染处理24 h后，向每个孔中添加10 μL CCK8试剂，并在37 ℃下孵育2~4 h，在多功能酶标仪上490 nm处测量光密度值D(490)。

GraphPad Prism 5统计软件统计数据，数据以 x±s示意，采选单要素方差分析，P < 0.05示意相反有统计学敬爱。

为了考据HBx是否得胜转染到14-19细胞中，通过qRT-PCR和Western blot检测HBx-EGFP-14-19细胞中HBx的抒发。与EGFP-14-19细胞和14-19细胞比较，HBx在HBx-EGFP-14-19细胞中特异性抒发(图 1A、C、E)。qRT-PCR和Western blot效果也标明，与泛泛组小鼠和EGFP组小鼠比较，HBx-EGFP-14-19组小鼠在30、90、180、360 d能踏实抒发HBx(图 1B、D、F)。

与未转染HBx的14-19细胞比较，HBx-EGFP-14-19细胞中miR-145 a-5p的抒发低于EGFP-14-19组和14-19组(图 2A)，而c-Myc和Kras的mRNA和卵白质的抒发增多(图 2)。

与未转染HBx的小鼠比较，miR-145a-5p在HBx小鼠中的抒发低于泛泛组和对照组，况且其抒发随时期下落(图 3A)。c-Myc的mRNA抒发在第30和90天，与对照组和盐水组比较无统计学敬爱，而第180和360天时其抒发赫然高于对照组和盐水组(图 3A)。然而，Kras的mRNA抒发在30、90、180 d时，低于盐水组和对照组，但在第360天显着高于盐水组和对照组(图 3A)。在对c-Myc和Kras卵白抒发进行检测时发现， 在30、90、180、360 d的卵白抒发均高于盐水组和对照组(图 3B、C)。标明HBx不错在体内和体外将miR-145a-5p看护在较低水平，从而裁减miR-145a-5p对c-Myc和Kras的颐养作用，并促进原癌基因c-Myc和Kras的抒发。

不雅察360 d的HBx小鼠肝脏组织时，发现一些小鼠有肉眼可见的直径约1 cm的结节性病变从肝脏名义凸起。HE染色效果傲气，肝小叶结构基本隐没，肝细胞异型增生且大小不一，核染色质浓染及多核(图 4)。

最初检测miR-145a-5p，c-Myc和Kras的抒发，效果标明，miR-145a-5p模拟物已得胜转染到HBx-EGFP-14-19细胞和HBx小鼠中。与对照组比较，miR-145a-5p的抒发量升高可逆转由HBx引起的体外(图 5A~G)和体内(图 6)c-Myc、Kras、细胞周期因子和凋一火因子的额外抒发。CCK-8效果标明，miR-145a-5p的过抒发不错扼制HBx-EGFP-14-19细胞的增殖(图 5H)。

与对照组比较，miR-145的体外抒发量裁减可促进由HBx引起的体外(图 7A~G)和体内(图 8)c-Myc、Kras、细胞周期因子和凋一火因子的额外抒发。CCK8效果标明，miR-145a-5p的低抒发不错促进HBx-EGFP-14-19细胞的增殖(图 7H)。

这项斟酌效果傲气，当HBx显着上调时，它会导致肝癌的发生。miR-145a-5p的抒发在HBx-EGFP-14-19细胞和HBx小鼠中均被下调。miR-145a-5p的抒发随转染HBx时期的增长而裁减。而当过抒发miR-145a-5p时可扼制HBx-EGFP-14-19细胞的增殖，下调miR-145a-5p则可促进HBx-EGFP-14-19细胞的增殖。机制斟酌标明，可能通过HBx-miR-145a-5p-c-Myc/Kras轴促进HCC的变成。

HBV在HCC的发生和发展中起宝贵要作用[15]。在HBV感染历程中，符合性免疫从免疫耐受搬动为进行性免疫刺激， 经误差活，激活和尴尬后，它会触发免疫响应疾病因子[16]。HBx是HBV病毒中的要道基因片断，可干扰多种细胞历程，举例氧化，DNA竖立，信号转导，转录，卵白质降解，细胞周期进度和凋一火。HBx的致癌要素可能是HBx介导的转录反式激活和信号通路[17]。HCC具有较高的发病率和升天率，现时有用的潜在调养纪律仍然仅限于手术切除和肝移植，给社会带来了千里重的职守[18]。在HCC的早期筛查中，并非老是偶然找到最庸碌使用的肝癌生物标志物-AFP(甲胎卵白)。因此，要紧需要寻找新的会诊和特异性生物标志物用于靶向调养[19]。

MiRNA失调可导致多种癌症并影响细胞稳态[20]。MiR-145可用于临床疾病的会诊，FU等[21]检测结核病患者血清中miR-145的抒发，并通过绘图特定的受体弧线来评估miR-145的会诊准确性。HE等[22]斟酌傲气，抗miR-145和减活miR-145均会触发小鼠肝脏的代谢性炎症。这从一定角度解释了HBx小鼠在老年期出现肝癌：miR-145在老年HBx小鼠中抒发较低，从而导致了代谢性肝炎和HCC。

为明白解HBx是否不错通过调控miR-145a-5p抒发导致肝癌的发生，咱们使用两种不同的纪律：扼制miR-145a-5p抒发和过抒发miR-145a-5p。效果标明，扼制miR-145-5p会导致细胞增殖和周期加速，细胞凋一火降速以及肿瘤因子的过度抒发。而miR-145a-5p的过抒发效果则与扼制miR-145a-5p相背。

作为miR-145a-5p的靶基因之一，c-Myc已被阐发为一种癌卵白，在多种癌症(包括HCC)和预后中均高度抒发[23-24]。在动物执行中发现，c-Myc的过度抒发可导致低分化HCC的发生。现在，c-Myc被合计是“弗成调养的”[25-26]。而miR-145a-5p的另外一个靶基因Kras在东谈主类肝癌中突变被合计是最高的过度抒发，Kras属于Ras家眷，HCC中发现Ras通路均被激活[27]。YE等[28]在转基因的Alb-Cre; Kras G12D小鼠中发现肝细胞特异性KrasG12D的抒发可引起小鼠肝细胞癌，而在KrasG12D和HBx双转基因小鼠中，HBx的共抒发促进了KrasG12D指引的HCC的发生和发展。以上斟酌标明，寻找c-Myc和Kras的上游调控因子不错扼制HCC的发生发展。

然而，基于miRNA的疗法的扩充仍靠近要紧挑战，主如若科罚miRNA模拟物/扼制剂被轮回RNA酶碎裂并将miRNA准确地寄递至病灶的问题。跟着好意思国食物药品监督照应局(FDA)批准首个用于调养可毁伤腹黑和神经功能的冷漠疾病的RNAi药物patisira，核酸药物已成为临床事实，也为核酸药物的临床应用带来了晨曦[29]。跟着新式冠状病毒的大家流行，RNA疫苗的斟酌也越来越多[30-31]。

要而言之，本斟酌通过不雅测miR-145a-5p在HBx-EGFP-14-19细胞和HBx小鼠中的生物学功能，为miR-145a-5p作为肝癌的会诊物和靶向调养奠定了基础哥也色，miRNA可能是今后在HCC进度中进行斟酌和干豫的新标的。

• 通过
• 哥也色
• HBx
• 遏止
• microRNA-145a-5p